Авторы

С современных позиций проанализирован материал по токсикологии фторацетата с целью возможного поиска решения проблемы терапии острых отравлений.

В опытах на лабораторных животных при различных способах введения ФОС исследована диагностическая и прогностическая значимость метода пупиллометрии. При инстилляции различных ФОС в конъюнктивальный мешок кроликов показана высокая степень чувствительности метода. Активность холинэстеразы при попадании в организм равного количества токсиканта не изменяется.

Предложен новый метод анализа высокотоксичного соединения — фторацетата натрия, методами газовой хроматографии с ионизационно-пламенным и масс-селективным детектированием в биологических пробах и воде. Метод основан на упаривании пробы досуха, этилировании сухого остатка этиловым спиртом в присутствии серной кислоты. Селективное определение фторацетата натрия в воде возможно с чувствительностью 0,001 мкг/мл, предел обнаружения в плазме крови и гомогенатах тканей, соответственно 0,01 мкг/мл и 0,01 мкг/г.

Предпринята попытка определения вклада циркуляторной гипоксии, клеточного звена гемостаза и нейротоксиэстеразы в реакцию организма на низкоуровневое воздействие фосфорорганических соединений (ФОС). В эксперименте изучены диизопропилфторфосфат, вызывающий отставленную нейропатию у человека и фосфакол (параоксон) не обладающий подобным эффектом. Проведено исследование активности эстераз холинэргической и нехолинэргической природы в плазме, в мозгу и в тромбоцитарной фракции крови; способности перитонеальных макрофагов к генерации активных форм кислорода; агрегационной активности тромбоцитов; влияния на функцию эндотелия сосудов. Полученные данные свидетельствуют о развитии неспецифической резистентности организма при хроническом действии ФОС. В то же время, очевидны качественные и количественные отличия в характере действия различных ФОС на разные звенья этого процесса.

В результате длительных экспериментов на белых крысах с использованием перорального пути поступления растворов Vx в дозах от 1·10-3 до 1·10-7 мг/кг разработана модель хронической интоксикации Vx, воспроизводящей основные звенья патогенеза интоксикаций.

На основании полученных результатов с привлечением данных литературы предлагается вероятный механизм развития ФОС-индуцированной хронической патологии, заключающийся в первичном фосфорилировании белковых молекул, функциональных нарушениях на клеточном уровне с последующим развитием иммунореактивных и гипоксических/ишемических процессов.

Обзор современных представлений о механизмах холинергической регуляции в норме и при воздействии биологических токсинов или химических отравляющих веществ, молекулярными мишенями действия которых являются звенья холинергической регуляции, а именно: системы синтеза и деградации ацетилхолина, везикулярный транспорт ацетилхолина и его действие на рецепторы. Рассмотрена роль ненейрональных холинергических систем в развитии последствий острой и хронической интоксикации фосфорорганическими соединениями.

Выявлены низкомолекулярные пептиды плазмы крови крыс, которые могут претендовать на роль биомаркеров острой и субхронической интоксикации ФОС. Обнаружен пептид с молекулярной массой 2245,1 Да SFSYKPRAPSAEVEMTAYVL, который присутствовал в плазме контрольных животных и отсутствовал в плазме крыс с острой или субхронической интоксикацией ФОС, а также через 1 месяц восстановительного периода. Идентификация пептида показала, что он является частью альфа-1-макроглобулина плазмы крыс. Предлагаются механизм образования данного пептида в плазме контрольных крыс и возможные причины его отсутствия в плазме отравленных животных. Кроме того, обнаружены и идентифицированы другие пептиды, которые могут быть новыми маркерами интоксикации ФОС.

Проведен анализ активности фермента параоксоназы-1 (PON1), в сыворотке крови у 80 жителей Кировской области с учетом полиморфизма гена PON1, приводящим к аминокислотным заменам в позициях PON1 Q192R, и PON1 L55M. Частота R-аллеля в популяции составила 25,6%, частота встречаемости M-аллеля составила 37,5%. Полученные значения являются близкими к значениям частот встречаемости этих аллелей у других европеоидных популяций.

Проведено исследование динамики ряда биохимических показателей крови крыс в течение 6 недель после острого отравления зоманом (GD) и веществом типа VX (RVX). Показано, что помимо изменения активности «классических» маркеров интоксикации фосфоорганическими отравляющими веществами (ФОВ), -холинэстераз крови,- дополнительными биохимическими маркерами интоксикации в ранние после острого отравления сроки может служить активность аминотрансфераз, гамма-глутамилтрансферазы и параоксоназы-1. Динамика креатинина и мочевины может отражать развитие отставленной патологии на поздних сроках (4-6 недель) после острого отравления животных ФОВ.

Проведен сравнительный анализ изменений, наблюдаемых в системе гемопоэза у крыс на протяжении 6 недель после острого отравления зоманом и RVX. Определены основные направления изменений и критические сроки их возникновения. Полученные данные позволяют более полно представить механизм токсического действия зомана и RVX, не связанный с непосредственным ингибирование холинэстераз, и имеют большое значение для практической медицины, поскольку дают возможность рассмотреть новые направления для разработки средств профилактики и лечения отравлений и их последствий.

«Эстеразный статус» - важный показатель, характеризующий индивидуальную реакцию организма на контакт с ФОС. В последнее время накапливается всё больше данных относительно его адекватной интерпретации с учётом целого ряда дополнительных токсико- и фармакодинамических факторов. В статье приведён анализ последних литературных данных по данной проблематике. Даны предложения по расширению спектра показателей, характеризующих «эстеразный статус».

Методами молекулярного моделирования произведена оценка взаимодействия зомана с двумя тирозиновыми сайтами связывания на поверхности альбумина: Tyr-411 и Tyr-150. Методом молекулярного докинга охарактеризованы процессы связывания четырех стереоизомеров зомана в двух сайтах связывания альбумина и проведена оценка влияния соседних аминокислотных остатков на эффективность связывания. Методом молекулярной динамики проверена стабильность комплексов между альбумином и зоманом.

Представлен обзор, отражающий современные представления о связыающей способности макромолекул организма по отношению к ксеноиотикам. Подробно описаны существующие и активно развивающиеся методы оценки взаимодействия макромолекул с ксенобиотиками. Даны общие рекомендации по проведению анализа.

Обзор посвящен проблемам поиска и использования биомаркеров в диагностике различных заболеваний с акцентом на сложности их применения в области токсикологии в частности в токсикологии фосфорорганических соединений (ФОС). Описаны фазы исследования при поиске биомаркеров и общие принципы оценки их диагностического значения. Описаны подходы к диагностике отравлений ФОС, предложены пути повышения эффективности поиска биомаркеров для диагностики отравлений ФОС.

В обзоре представлены данные о механизмах действия активных форм кислорода (АФК). Клетки врожденного иммунитета могут генерировать относительно высокие концентрации АФК для борьбы с патогенами. В то же время низкие концентрации АФК постоянно образуются практически во всех клетках организма и выполняют сигнальные функции в качестве вторичных посредников в редокс-чувствительных сигнальных путях. Исследование механизмов модуляции внутриклеточного гомеостаза, роли эндогенных и экзогенных источников АФК необходимо для понимания патогенеза заболеваний, действия лекарственных и токсических веществ.

В статье описаны современные представления о превращениях ФОВ V-типа in vitro и in vivo. В опытах in vitro выявлен новый ковалентный аддукт RVX с белками плазмы крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-селективным детектированием в режиме высокого разрешения. Получены данные для оценки вклада альбумина в процесс детоксикации RVX.

Впервые исследовано влияние зарина (GB), зомана (GD) и российского вещества Vx (RVX) без применения и с применением антидотных препаратов (карбоксим или карбоксим в смеси с атропином) на качественный и количественный состав свободных и этерифицированных жирных кислот (СЖК и ЭЖК, соответственно) плазмы крови. Введение крысам доз GB и GD на уровне DL50 вызывает уменьшение концентраций СЖК в плазме крови через 3 часа. Через 24 часа уровень СЖК возвращается к норме. Введение 2 0.4DL50 RVX обусловливает повышенный уровень ЭЖК и СЖК в плазме крови в течение недели, в том числе обогащение полиненасыщенными кислотами фракции СЖК. Антидотная терапия нормализует динамику СЖК и ЭЖК, но не предотвращает изменения их уровней в первые часы. RVX в отличие от фосфорорганических пестицидов на уровне DL50 ингибирует ацетилхолинэстеразу (АХЭ), но не влияет на липидный обмен в первые 24 часа.

Исследовано влияние реактиватора холинэстераз карбоксима на возможность определения маркеров VR (О-изобутил-S-(2-диэтиламиноэтил)метилтиофосфоната) в биопробах, полученных в остром эксперименте in vivo после отравления крыс в дозе 2 0,4ЛД50 с интервалом 1 час. Установлено, что ацетилхолинэстераза (АХЭ) является более чувствительным биомаркером по сравнению с бутирилхолинэстеразой (БХЭ) плазмы крови. Использование карбоксима приводит к реактивации АХЭ в течение 3-х часов после отравления, тогда как в отсутствие терапии реактивация происходит в течение 3-х дней. Регенерация фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ) из состава белковых аддуктов плазмы крови с помощью фторид-иона в условиях эксперимента была возможна в течение 7 дней независимо от применения антидота. Влияние реактиватора на экскрецию продуктов гидролиза VR оказалось значительным. Через сутки после отравления и введения карбоксима О-изобутилметилфосфонат (ИбМФК) был идентифицирован в моче на уровне 17 нг/мл, в то время как в образцах мочи животных, не получавших реактиватор, на уровне 7,4 нг/мл; через трое суток ИбМФК был определен только в моче животных, не получавших антидот, на уровне 1 нг/мл. Также установлено, что содержание свободных и этерифицированных жирных кислот в плазме крови животных, не получавших антидот, становится максимальным на 7 сутки после отравления и, таким образом, может дополнить комплекс токсикодинамических показателей отравления VR.

Исследовано влияние антидота пеликсима на возможность определения маркеров фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ) G-типа - зарина и зомана в биопробах, полученных в остром эксперименте in vivo после отравления крыс ФОВ в дозах 0.5 ЛД50. Установлено, что введение эквитоксических доз зомана и зарина приводит к снижению активности АХЭ мембран эритроцитов вплоть до 7 дней после отравления. Результат действия пеликсима на восстановление активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ) эритроцитов наиболее выражен через сутки после отравления зарином. Регенерация ФОВ из состава белковых аддуктов плазмы крови с помощью фторид-иона в условиях эксперимента была возможна в течение периода до 7-ми дней после отравления зоманом без применения антидотной терапии и 3-х дней с применением терапии; при отравлении зарином - в течение 3-х дней независимо от применения антидота. Влияние антидота на экскрецию продукта гидролиза зарина – О-изопропилметилфосфоната (ИМФК) оказалось значительным, в то время как на экскрецию гидролитического метаболита зомана О-пинаколилметилфосфоната (ПМФК) введение антидота влияния не оказывало. Через сутки после отравления и введения пеликсима ИМФК был идентифицирован в моче на уровне 15.3 нг/мл, в то время как в образцах мочи животных, не получавших антидот, на уровне 55.0 нг/мл; через трое суток ИМФК был определен только в моче животных, получавших антидот, на уровне 4.9 нг/мл. Содержание ПМФК в моче животных, получивших антидот составляло 44 нг/мл через сутки после отравления, без антидота – 53 нг/мл, через 3 суток - 12 и 14 нг/мл, соответственно. Таким образом, влияние антидота на профиль экскреции гидролитических метаболитов значительнее для зарина, чем для зомана.

Впервые исследовано хроническое ингаляционное воздействие низких концентраций алифатических углеводородов (УВ) на метаболические профили низкомолекулярных органических соединений, в том числе свободных (СЖК) и этерифицированных (ЭЖК) жирных кислот головного мозга и печени крыс. В качестве аналитических методов были использованы газовая и жидкостная хроматомасс-спектрометрия. Перечень УВ включает гексан, гептан, октан, нонан и декан в различных соотношениях. Выявлены изменения профилей низкомолекулярных соединений головного мозга при воздействии смеси УВ в концентрации 160 ± 20.5 мг/м3 в течение 90 суток, в то время как воздействие смеси УВ в более низких концентрациях - 31.4 ± 5.6 мг/м3 и 5.2 ± 1.08 мг/м3, приводит лишь к незначительным изменениям профилей. Выявлено значительное повышение концентраций лизофосфолипидов, в основном лизофосфатидилхолинов, в экстракте из головного мозга и плазме крови. Повышение содержания лизофосфолипидов в тканях мозга можно рассматривать как следствие деструкции клеточных мембран, характерной для нейродегенеративных процессов. В то же время, повышение концентрации лизофосфатидилхолинов в мозге сопровождается статистически значимым уменьшением концентрации глицерол-3-фосфата и не сопровождается изменениями концентраций глицерофосфохолина, глицерофосфоэтаноламина, холина, ацетилхолина, СЖК или лизофосфатидной кислоты. Показано, что концентрации лизофосфатидилхолинов и лизофосфатидилэтаноаминов, отнесенные к концентрациям глицерофосфохолина и глицерофосфоэтаноламина в плазме крови, могут служить потенциальными маркерами влияния УВ на головной мозг.

Одна из актуальных задач клинической токсикологии – разработка терапии, направленной на стехиометрическую и/или каталитическую детоксикацию фосфорорганических соединений (ФОС) в кровеносном русле, что предотвратит попадание яда в нервно-мышечные и нейрональные синапсы и поможет избежать необратимых последствий отравления. Вспомогательным вариантом детоксикации ФОС в кровеносном русле может стать направленное воздействие на альбумин, основной транспортный белок крови, с помощью молекул, модулирующих его связывающие и/или эстеразные свойства. Цель представленного исследования – методами молекулярного моделирования на примере параоксона и олеиновой кислоты оценить влияние жирных кислот на связывающую и эстеразную активность альбумина человека по отношению к ФОС. Согласно полученным данным, повышенная концентрация жирных кислот в крови будет снижать вероятность связывания параоксона с альбумином и уменьшать вероятность псевдоэстеразной реакции.

Отравления фосфорорганическими соединениями (ФОС) занимают в общем числе экзотоксикозов одно из ведущих мест. Детоксикацию ФОС на первом этапе попадания в организм можно обеспечить с помощью ДНК- или РНК-аптамеров, связывающих яд в кровеносном русле. В настоящее время основным способом поиска аптамеров является экспериментальный метод систематической эволюции лигандов экспоненциальным обогащением (SELEX). В процессе селекции аптамеров необходима иммобилизация молекулы-мишени через стрептавидин-биотиновый комплекс. Поскольку молекула отравляющего вещества имеет небольшие размеры, для увеличения ее доступности для связывания с аптамером необходимо использование спейсера между ФОС и биотином. Цель данной работы – на примере параоксона оптимизировать процедуру селекции аптамеров к ФОС путем увеличения доступности иммобилизованной через стрептавидин-биотиновый комплекс молекулы отравляющего вещества. Для этого методами молекулярного моделирования были протестированы три спейсера между ФОС и биотином: три звена полиэтиленгликоля (3-ПЭГ), четыре звена полиэтиленгликоля (4-ПЭГ) и аминогексил. Конформация комплекса биотинилированного параоксона со стрептавидином и процесс взаимодействия параоксона со связывающим фрагментом аптамера были смоделированы методами молекулярного докинга и молекулярной динамики. Оценка возможности биотинилированного параоксона связаться с аптамером была проведена путем анализа площади поверхности параоксона, доступной растворителю, а также с помощью расчета свободных энергий связывания. Было показано, что только в случае использования аминогексила иммобилизованный параоксон может связаться с аптамером. На заключительном этапе был проведен синтез параоксона, связанного с биотином через аминогексил.